Defenisi
       Kromatografi adalah teknik pemisahan  campuran didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen-komponen  campuran tersebut diantara dua fase,  yaitu fase
diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).
 Bila fase diam berupa  zat padat yang  aktif, maka dikenal istilah kromatografi
penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini
disebut kromatografi pembagian (partition chromatography).

Jenis-Jenis Kromatografi
        Berdasarkan fase gerak yang  digunakan, kromatografi dibedakan  menjadi dua
golongan besar yaitu  gas chromatography dan liquid  chromatography. Masing-masing
golongan dapat dibagi lagi seperti yang telah disebutkan pada definisi di atas. 

Pembagian ini selanjutnya dapat dibagi lagi seperti telihat pada skema berikut:
KROMATOGRAFI   :    
  1. Kromatografi Gas
             a. GLC
             b. GSC
   2. Kromatogarafi Cair
             a. HPLC
             b. LLC-PC
             c. LSC-TLC, Kolom
             d. Ion Excange
             e. Ekslusi : - GP
           - GF
Keterangan
GLC   = Gas Liquid Chromatography
GSC   = Gas Solid Chromatography
LLC    = Liquid Liquid Chromatography
LSC    = Liquid Solid Chromatography
PC     = Paper Chromatography
TLC    = Thin Layer Chromatography
GP     = Gel Permeation
GF      = Gel Filtration
HPLC = High Performance Liguid Chromatography

Liquid Liquid Chromatography (LLC)
LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak dan fase
diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak.
Umumnya sebagai fase diam digunakan  air dan sebagai fase gerak adalah pelarut
organik. Misalnya pada kromatografi  kertas, sebagai fase diam adalah air yang  terserap
pada serat selulosa dari kertas.

Liquid Solid Chromatography (LSC)
LSC adalah kromatografi penyerapan.  Sebagai adsorben digunakan silika gel,
alumina, penyaring molekul atau gelas  berpori dipak dalam sebuah kolom dimana
komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini.

Ion-exchange chromatography
Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar  ion.
Senyawaan yang mempunyai ion-ion  dengan afinitas yang berbeda terhadap  resin yang
digunakan dapat dipisahkan. 
 Analisa asam-asam amino adalah yang umum dilakukan dengan cara ini. Contoh lain
adalah asam-asam nukleat dan analisis garam-garam anorganik.

Exclusion chromatography
Dalam teknik ini, gel nonionik berpori banyak dengan ukuran yang sama digunakan
untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM). 
Molekul-molekul yang kecil akan memasuki  pori-pori dari gel sedangkan molekul
besar akan  melewati  sela-sela gel lebih cepat bila dibandingkan  dengan molekul yang
melewati pori-porinya. Jadi  urutan elusi mula-mula adalah molekul yang lebih  besar,
molekul sedang, dan terakhir molekul yang  paling kecil. Bila sebagai penyaring digunakan
gel yang hidrofil (Sephadex) maka teknik ini disebut gel  filtration chromatography dan bila
digunakan gel yang  hidrofob (polystyrene-divinylbenzene) disebut  gel  permeation
chromatography.
Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang  farmasi yaitu kromatografi
kolom,  kromatografi  kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, dan  high
performance liquid chromatography (kromatografi cair kinerja tinggi / KCKT).

Teori
 Martin dan Synge adalah yang pertamakali menulis tentang teori liquid partition
chromatography.  Prinsip teori yang  dikemukakan itu dapat diterapkan untuk  semua jenis
kromatografi.

 Pemisahan terjadi karena molekul sampel tertahan oleh fase diam atau dibawa oleh
fase gerak, tergantung dari afinitas senyawa tersebut terhadap kedua fase ini.
Koefisien distribusi
 Distribusi dari molekul-molekul sampel  diantara dua fase ditentukan oleh tetapan
kesetimbangan yang dikenal dengan koefisien distribusi, K (koefisien partisi).
                                   K = Cs/Cm
K     = koefisien partisi
Cs   = konsentrasi sampel dalam fase diam (stationary phase)
Cm   = konsentrasi sampel dalam fase gerak (mobile phase)
Bila harga K, besar berati populasi molekul dalam fase diam lebih besar daripada fase gerak
dan berarti rata-rata lebih lama tertahan dalam fase diam.
Faktor kapasitas
K’ =    = capacity factor =   = perbandingan molekul sampel dalam fase diam dengan     
                                                            fase gerak.

  K’ Adalah nilai yang menunjukkan seberapa kuay  komponen-komponen dalam
sampel yang dibawa oleh fase gerak berinteraksi dengan kolom (fase diam).
Laju pemisahan
Apabila bagian waktu yang dibutuhkan oleh molekul  sampel pada fase gerak dikalikan
dengan kecepatan linier  (u) dari fase gerak maka diperoleh  laju pemisahan (rate of  travel)
dari molekul rata-rata.
Rate = u  
Jadi, laju pemisahan ditentukan oleh :
1. Kecepatan fase gerak (sama untuk tiap komponen campuran).
2. Perbandingan dari volume fase diam dengan fase gerak  (sama untuk tiap komponen   
campuran) 
3. Koefisien distribusi (spesifik untuk tiap komponen campuran).
Retention time
Waktu yang diperlukan oleh sebuah komponen sampel untuk melintasi kolom sepanjang L
disebut ‘retention time’ (t). Dari definisi ini, laju pemisahan diperoleh:
t=  =  = ( 1 + K’) = tM(1 + K’)
tM= waktu yang diperlukan oleh fase gerak untuk melintasi kolom sepanjang L.
Persamaan ini merupakan persamaan dasar untuk semua jenis kromatografi. Dalam
praktek sering  diterapkan pada kromatografi gas  dan definisinya  dapat diubah menjadi
retention time, yaitu waktu  yang diperlukan oleh sampel mulai dari saat injeksi  sampai
timbulnya peak maksimum.
Retention volume
Bila kecepatan dari fase gerak konstan, maka volume dari fase gerak yang diperlukan
untuk memisahkan suatu  komponen campuran dari kolom dapat dihitung dengan  rumus
berikut :
Volume = waktu x kecepatan aliran
         VR = tRF
Bila persamaan retention time disubstitusikan ke dalam persamaan ini maka diperoleh:
                 VR = Vm (1 + K’) = Vm + KVs
    Vm = volume dari fase gerak dalam kolom
                 Vs = volume dari fase diam
Bila fase diam berupa zat padat maka Vs dapat dirubah menjadi luas permukaan / area
(adsorption) atau dengan kapasitas penukar ion. 

Relative retention (selektifitas, α)
α adalah nilai yang menunjukkan seberapa baik sistem kromatografi dapat memisahkan dua
komponen. 
Retention time dan retention volume kurang  tepat jika dipakai untuk identifikasi
dengan membandingkan data-data lainnya karena hargaharga  ini sangat tergantung dari
cara pembuatan kolom dan kondisi percobaan. Untuk menghilangkan efek dari operasional
variabel,  maka lebih baik digunakan harga relative  retention yaitu perbandingan antara
retention time sampel dengan retention time standar yang diperoleh dari kolom yang sama
dengan kondisi percobaan yang sama.
Plate theory (N)
Martin dan Synge melihat adanya  persamaan proses yang terjadi pada  kolom
kromatorafi dengan kolom destilasi bertingkat kemudian menerapkan konsep “theoretical
rate” pada pemisahan dengan destilasi ke dalam kromatografi.
Harga N ditentukan oleh kontruski kolom, sifat sampel. Flow rate, temperature, cara
memasukkan sampel dll. Ada 2 cara memperbesar harga N yaitu dengan memperpanjang
kolom dan dengan memperpanjang jumlah keseimbangan (equilibrium) alam jangka waktu
yang sama.
Rate theory
Dalam praktek harga H selalu lebih besar dari harga  idealnya (nol) yang berarti
terjadi pelebaran peak. Pelebaran ini disebabkan oleh 3 faktor yaitu:
1. Efek perbedaan jarak (eddy diffusion)
Perbedaan jarak yang dilalui oleh molekul yang satu  dengan yang lain disebabkan
perbedaan bentuk,  ukuran partikel-partikel pengisi kolom, cara pengisian  kolom, dan
diameter dari kolom. Perbedaan ini  mengakibatkan perbedaan waktu keluarnya

molekulmolekul dari kolom. Untuk memperkecil efek ini, digunakan partikel-partikel kecil
yang serba sama  tetapi tidak menyebabkan penurunan tekanan dalam  kolom terlalu
tinggi, diameter kolom yang kecil,  pengepakan yang mampat dan serba sama tanpa
memecahkan partikel-partikel pengisi kolom tersebut. 

2.Difusi molekul sepanjang kolom 
Molekul-molekul cenderung untuk  berdifusi dari daerah yang  konsentrasinya tinggi ke
daerah yang  konsentrasiya rendah. Akibatnya, waktu melintasi kolom, molekul-molekul
akan menyebar (berdifusi) ke belakang dan ke depan.

3. Efek ketidaksinambungan
Aliran yang terus-menerus dari fase gerak  menyebabkan penyimpangan dari
keseimbangan dimana Cs/Cm selalu lebih kecil dari K pada tepi zona yang didepan dan
selalu lebih besar pada tepi zona yang di belakang seperti terlihat pada gambar di atas
(c). Pada partition chromatography, efek ini makin nyata bila kekentalan fase diam makin
tinggi.

Resolusi
Merupakan ukuran apakah suatu senywa terpisah secara baik atau tidak dengan
senyawa lain. Perubahan kecil pada nilai α akan menyebabkan nilai resolusi berubah secara
signifikan....